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使用Nanopore和Illumina對全耐藥性肺炎克雷伯菌基因組進行測序,組裝和注釋

本研究使用Illumina和Nanopore平臺對一株全耐藥性的肺炎克雷伯菌KP58進行測序,通過混合基因組組裝,可以獲得高質量的全基因組序列,包括1個環狀染色體和5個環狀質粒。該菌株具有多種抗生素耐藥性和毒力因子。對粘菌素的抗性與一個類似ISKpn26插入到mgrB基因中有關;對替加環素的抗性與AcrAB外排泵系統的過度表達有關。與KP58親緣關系最近的是從杭州收集的另一種臨床分離株,僅相差10個cgMLST位點。這些數據將為肺炎克雷伯菌感染的預防、診斷和治療策略提供重要指導。

發表雜志:Infection and Drug Resistance

發表日期:2020年2月

影響因子:3.12
 

研究背景
多藥耐藥性肺炎克雷伯菌在世界范圍內的傳播日益增加,與高死亡率的各種感染有關。本研究報道了肺炎克雷伯菌株KP58的全基因組序列,這是一種全耐藥性的肺炎克雷伯菌株,在中國對粘菌素和替加環素具有較強的抗性。

 

材料方法

KP58是杭州一名89歲的患者尿液中分離培養得到,患者住院期間使用多種廣譜抗生素,包括頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、替加環素和大腸菌素。進行抗菌藥敏試驗,測定最低抑菌濃度(MICs)。采用Illumina和Nanopore技術進行全基因組測序,組裝后對基因組特征、耐藥基因和毒力基因進行綜合分析;對肺炎克雷伯菌KP58和密切相關的菌株進行基因組流行病學和系統發育分析。

 

主要結果

Illumina測序獲得912Mb 數據,reads質量值均在Q30以上。Nanopore MinION測序獲得76K reads,平均reads長度為9.8kb(N50 19Kb, 最長read 125Kb),測序數據量為746.5Mb; Q值為9的reads大于3K,數據量為368.8Mb。
 
使用混合組裝,獲得KP58的全基因組序列,包括1個環狀染色體(5.5Mb)和5個質粒(197kb,135kb,87kb,12kb和5.6kb)(圖S2)。注釋到5913個蛋白編碼基因,85個tRNA基因和25個rRNA操縱子;基因組完整性為98.62%,污染率和菌株異質性分別為0.36%和0%,表明組裝獲得的基因組質量較高。
 


圖S2 全基因組圈圖

注:(A)為染色體,(B)-(F)為質粒
 

與藥物敏感性數據一致,KP58含有多種耐藥基因,包括aadA2,rmtB,blaCTX-M-65,blaKPC-2,blaTEM-1B,blaSHV-12,blaSHV-182,qnrS1,fosA,catA2,sul2,tet(A)和dfrA14,對β-乳糖、氟喹諾酮類、酚類、磷霉素、磺胺類、四環素類和甲氧芐啶具有耐藥性。此外,對喹諾酮類耐藥決定區(QRDR)的分析還發現了靶基因的改變,包括GyrA(S83I和D87G)和ParC (S80I)的突變。

 

 

使用qRT-PCR測定了替加環素抗性相關的外排泵基因(如acrA,acrB,ramA,marA,soxS和acrAB)的表達水平,表明KP58的替加環素抗性與AcrAB外排系統的過表達有關。還發現了無質粒載體的替加環素抗性基因tet(X)。雖然分離株對mcr基因呈陰性,但它攜帶了一種類似ISKpn26的元件插入到mgrB基因中,這是一種已知的賦予粘菌素抗性的插入。

 

還發現了三種潛在的毒力因子,包括對aerobactin, hypermucoviscosity(高粘液性)和 yersiniabactin(耶爾森菌素)的響應。KP58被確定為ST11型,這是一種廣泛傳播的多藥耐藥K. pneumoniae克隆系,在世界范圍內造成嚴重感染。用Kaptive預測KP58的KL型(多糖膠囊和脂多糖O抗原),為KL64。還鑒定了屬于不相容(Inc) F組[IncFIB, IncR, 和 IncFII]和ColRNAI 4個質粒的復制子。

 

使用垂直遺傳核心基因組SNPs和核心基因組MLST分析,評估KP58與從中國收集的416株ST11 K. pneumoniae菌株之間的系統發育關系。系統發育樹具有很高的多樣性,最具地理相關的菌株被分為相同的類群,其差異為<10個SNPs(圖1)。大多數從四川和杭州收集的分離株,含有最高比例的已知的抗生素耐藥決定因子。結果表明,與KP58關系最密切的菌株是L39_2的,另一種從杭州人糞便樣品中分離的ST11菌株,這些菌株僅有10個cgMLST位點或9個SNPs(圖2)。
 

圖1 ST11核心基因組系統進化樹及耐藥基因分布



 

圖2 KP58與克雷伯菌株之間的系統發育關系

注:(A)從中國收集的所有肺炎克雷伯氏菌ST11菌株的最小生成樹(B)與KP58密切相關的菌株的最小生成樹。
 

在KP58質粒中,攜帶碳青霉烯類耐藥基因blaKPC-2的IncR/IncFII 質粒(134,972bp),與中國成都分離的產生KPC-2的菌株wchkp020037的質粒pKPC2_020037具有99%的同源性和75%的覆蓋率。發現pKP58-2的骨架區含有復制和穩定質粒的基因,但缺乏共軛基因。

 

質粒pKP58-2上blaKPC-2的遺傳背景由Tn3-tnpA,Tn3-tnpR,ISKpn27,Tn3-ΔblaTEM-1,blaKPC-2,ΔISKpn6,korC,klcA,ΔrepB和ΔTn1721組成,幾乎與三個質粒:p3_L39、p2b2和pKPC2_020037的組成相同。

 

另一個IncFII型質粒(87,095bp)含有耐藥基因qnrs1、tet(A)、cata2、sul2和dfra14,已知它們分別對氟喹諾酮、四環素、酚類、磺胺類和甲氧芐啶具有耐藥性。

 

 

此外,一組由iucABCD,iutA,rmpA和rmpA2組成的毒力基因均位于IncFIB/IncHI1B質粒(197,415bp)上,而在同一質粒中未檢測到抗性基因。將這種毒力質粒命名為pKP58-1,并與NCBI GenBank數據庫中的其他質粒進行比較,結果顯示其與先前報道的三種毒力質粒具有同源性,包括pK2044(99%同源性和93%覆蓋率)、pLVPK(99%同源性和89%覆蓋率)和pVir-CR-HvKP4(99%同源性和78%覆蓋率)。此外,pKP58-1的大小小于pK2044和pLVPK這兩個質粒,但大于pVir-CR-HvKP4(178,154bp)(圖3)。
 

圖3 不同菌株攜帶的8種毒力編碼質粒的遺傳比較

結論

本研究使用Illumina和Nanopore平臺對一株全耐藥性的肺炎克雷伯菌KP58進行測序,通過混合基因組組裝,可以獲得高質量的全基因組序列,包括1個環狀染色體和5個環狀質粒。該菌株具有多種抗生素耐藥性和毒力因子。對粘菌素的抗性與一個類似ISKpn26插入到mgrB基因中有關;對替加環素的抗性與AcrAB外排泵系統的過度表達有關。與KP58親緣關系最近的是從杭州收集的另一種臨床分離株,僅相差10個cgMLST位點。這些數據將為肺炎克雷伯菌感染的預防、診斷和治療策略提供重要指導。

 

參考文獻

Ruan Z, Wu J, Chen H, Draz MS, Xu J and He F. Hybrid Genome Assembly and Annotation of a Pandrug-Resistant Klebsiella pneumoniae Strain Using Nanopore and Illumina Sequencing. Infect Drug Resist. 2020;13:199-206.


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