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利用Nanopore高通量測序技術解析污水處理體系可移

 
發表期刊:Microbiome
發表時間:2019年7月
影響因子:10.46
 

研究背景
 
抗生素抗性基因(ARG)的出現和廣泛傳播嚴重影響了人類的身體健康,污水處理廠作為一個連接人類活動和自然生態系統的重要節點,具有豐富的微生物遺傳多樣性,可通過基因水平轉移(HGT)促進ARG的交流。污水中殘留的抗生素以及其它共選擇篩選壓力,使其對抗生素抗性基因的水平轉移起到了重要作用。
 
目前有多種可移動遺傳元件,包括質粒(Plasmid)、整合性結合元件(ICEs)、轉座子(Transposon)、以及整合子(Integron) 能夠介導抗性基因的轉移。為了能夠全面了解污水處理體系中抗生素抗性基因以及多重耐藥菌株的動態傳播過程,解析不同抗生素抗性基因的遺傳背景、宿主信息并且追蹤它們在整個污水處理體系過程中的變化是十分必要的。
 
然而不管是基于傳統的耐藥菌株分離培養的方法,還是基于二代測序組裝、或者epicPCR的方法都不能達到理想的效果。隨著三代測序技術的發展,長讀長的特點可以彌補上述技術的缺點。作者開發了一套基于高通量測序的抗生素抗性基因遺傳背景解析、宿主鑒定的分析流程,確定了三個污水處理廠進水和出水中多重耐藥細菌的表型和基因型之間的相關性,為解析復雜的遺傳元件提供了可能性。
 

材料和方法
 
1.測序樣品
一共11個樣品,包括9個水樣:香港沙田、石湖墟、史丹利的3個污水處理廠的進水口、活性污泥、出水口樣品,和2個對污水處理體系進水和出水中的多重耐藥菌株進行分離培養的樣品。
 
2.樣品處理
進水口和活性污泥樣品在取樣現場使用同等體積的100%乙醇固定。另外,從每個污水處理廠收集了50 mL未固定的進水口樣品,以進一步分離具有多重耐藥性的細菌。所有樣品均在2小時內被運送到實驗室進行立即處理。對于每個進水樣品,取5000 mL樣品在室溫下5000 rpm離心15分鐘后收集沉淀。對于每個出水口樣品,取1 L樣品通過0.45 μm硝酸纖維素膜過濾后收集固體。DNA提取前,所有處理過的樣品均保存在-20℃冰箱。
 
3.多重耐藥菌的培養
對于每種無乙醇固定的進水樣品,取100μL接種到添加100 mg / L氨芐青霉素,50 mg / L卡那霉素,20 mg / L四環素和25 mg / L氯霉素的LB培養基平板上。對于出水口樣品,將膜上的細菌沉淀物重懸于1 mL LB培養基中,然后將100μL重懸液鋪在如上所述的相同類型的LB瓊脂平板上。在37℃下孵育過夜(12 h)后,使用LB洗滌孵育在LB平板上生長的菌落/分離物(大約500個菌落/分離物)三次,收集用于DNA提取和下游分析的混合多重耐藥培養物。
 
4.DNA提取與建庫
使用FastDNA® Spin Kit for Soil提取污水處理廠樣品的DNA,用DNeasy PowerSoil試劑盒從每個培養皿中提取混合分離物的總基因組DNA,電泳后,提取大于8kb的DNA片段,使用Monarch®DNA凝膠提取試劑盒進行回收。用AMPure XP磁珠對DNA進行純化。用Nanodrop對DNA純度進行檢測,使用OD 260/280 約1.8 和OD 260/230 在2.0–2.2的樣品進行文庫構建。三代測序使用MinION測序,每個樣品平均得到3.4Gb的數據,二代測序使用Illumina Hiseq4000平臺進行PE150測序,每個樣品平均得到14.5Gb數據。
 
5.MinION文庫構建測序
使用LSK108連接試劑盒構建1D類型DNA文庫,按照以下步驟進行文庫制備,對于單個DNA樣品,使用瓊脂糖凝膠純化方式回收的1.5–2.0μg DNA。
 
① 末端修復:使用NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing進行,將7行,Next Ultra II End-緩沖液,3沖液,ext Ultra II End-酶混合物,1.2物,xt Ul體積50ul)混合,首先在20,首下孵育20分鐘,然后在65,下再孵育15分鐘;
② 
③ 磁珠純化:使用60ul  AMPure XP進行純化;
 
④ 連接:混合20ul Adaptor Mix和50 0L of Blunt/TA Ligation Master Mix加入30 μL dA-tailed DNA進行連接,室溫下孵育15分鐘;
 
⑤ 再次純化:使用40純化:育daptor M珠粒和ABB緩沖液進行另一次純化以除去接頭序列,使用25液進行另一次重懸純化連接DNA,然后通過Qubit測量濃度,以確保保留了≥量濃度,以確的DNA;
 
⑥ 測序:使用R9.4芯片進行MinION測序,所有樣品總共進行了11次獨立的MinION測序。
 
6.MinION分析
MinION數據下機后使用Albacore (v2.1.10)進行base-called,使用PoreChop軟件(--discard_middle)處理得到Passed reads。使用Nano-Pack對數據進行統計和可視化。
 
抗性基因的鑒定使用LAST軟件(version 926,-a 1 -b 1 -q 2)比對SARG數據庫。過濾參數:比對的長度覆蓋度(cover)>ARG長度的95%,相似度(similarity)>80%,當overlapped ARG-containing regions (> 80%)時選取最好的比對結果。
 
使用PlasFlow軟件推斷質粒的ARGs。使用Centrifuge(v1.0.3)的Nr庫對攜帶ARGs的reads進行物種分類分析,使用Pavian對結果進行可視化。
 
使用LAST工具(version 926)對位于攜帶ARG的reads上的轉座子和整合子進行鑒定,比對NCBI的RefSeq數據庫,保留alignments >60%,identity ≥sentof the marker protein (transposase or integrase) length的reads。ICE攜帶的ARG是基于reads比對ICEs數據庫得到的,參數設置相似性(similarity)> 80%確定。同時對比對長度>50%的ARG總長進行預過濾,最后通過blast比對Nr數據庫交叉驗證和手工檢查確定。
 

7.Illumina數據分析
Illumina下機數據過濾得到clean data, 使用CLC的Genomic Workbench (version 6.04, 默認參數)對每個樣本進行組裝,共生成4062135個contigs。
 
使用Prodigal (v2.6.3)預測ORF序列。使用BLASTN對上述ARG-like ORF序列比對SARG數據庫,設參數similarity of 80%;coverage of 95%。
 
使用PlasFlow預測所有帶有ARGs的contigs的質粒序列。為了比較Illumina和Nanopore測序平臺對混合的多重耐藥性培養物的物種分類,使用Centrifuge對Illumina序列進行物種分類。
 
使用Ribotagger對宏基因組數據中16S序列的V4-V6區域進行群落分析,然后使用EMIRGE重構近全長16S rRNA序列(40 iterations)。通過在線BLAST比對Nt數據庫對16S rRNA序列進行系統發育注釋,并利用EMIRGE對重構基因的相對豐度進行估算。
 
8.比較Nanopore  Illumina測序定量結果
為了比較Illumina和Nanopore測序產生的結果,使用每百萬堿基對的ARG數進行定量。得到ARGs-like的reads后,根據基因長度和測序深度計算豐度和標準化,使用person相關系數和線性回歸進行分析。
 

研究結果
 
1.測序結果統計
 
Nanopore測序平均每個樣品測得3.4Gb的數據,N50為5,872~10,674bp,單條reads最長達到73,530bp。與這些環境樣品的直接測序相比,2個培養的多重耐藥菌樣品測得了更長的reads(N50:16,578bp)和更高的數據量。但是,通過選擇不同的DNA提取策略和文庫制備方法,可以得到更長的reads。
 
值得注意的是,Nanopore reads長度(平均5.3 kb;N50 8.1 kb)比平均深度達到14.5 Gb的Illumina拼接出的contigs (平均 1.4 kb; N50 1.7 kb)還長,表明其有助于分析這些ARGs的相關信息。


Fig S1  Nanopore reads 統計 


Table S1 Nanopore結果與Illumina測序拼接結果比較




2.攜帶抗性基因的質粒和整合性結合元件在污水處理體系抗性基因組中占主導地位

鑒定出1791個帶有ARGs的Nanopore reads(平均長度為8.5 kb),遠遠大于從Illumina序列組裝的316個ARGs的contigs(平均2.9 kb),表明很難通過二代Illumina序列來評估ARGs的遺傳背景。
 
基于抗性基因的移動潛力,該研究將檢測到的ARGs分為兩大類,第一類:能夠在細胞間水平轉移的可移動抗性基因組,這類抗性基因位于能夠介導細胞間轉移的移動元件上,包括質粒和整合性結合元件;第二類為基因組(染色體)上攜帶的低移動風險抗性基因組。
 
Nanopore結果顯示,相比于少量位于基因組上的抗性基因(29%),大部分抗性基因由質粒和整合性結合元件攜帶(55%),并且在攜帶抗性基因的質粒上,其它的移動元件,包括轉座子和整合子比位于基因組上的分布更加廣泛,這些移動元件對于質粒上抗性基因的快速富集和積累至關重要。
 
某些樣品中的幾種ARGs類型僅通過Illumina測序檢測到,但Nanopore測序未檢測到的這些ARGs的相對豐度非常低(占總抗性基因組的4%)。說明即使是低深度的Nanopore測序也可以充分覆蓋主要的ARG類型,且除了多重耐藥ARG以外,所有其他檢測到的ARG都主要由質粒攜帶,這些都是污水處理廠抗性基因的重要組成部分(圖1),并且與Illumina分析結果一致, 說明污水處理廠的微生物群落可以包含大量編碼,對幾乎所有臨床相關抗生素具有抗性的質粒。


Fig 1 抗生素抗性基因遺傳背景解析
 

除了質粒攜帶的ARG外,還發現ICEs攜帶了13個抗性基因亞型,包括氨基糖苷類(aadE)、βa內酰胺類(CfxA、CfxA2和CfxA3)、氯霉素類(catQ)、MLS類(ermB、mefA/E、ermF、ermG和ermC)以及四環素類(tetQ、tetM和tetO),其中位于ICEs上的四環素和MLS類的抗生素具有相對較高的豐度,分別占相應ARG類型的22%和17%,因此ICEs對于抗性基因的傳播或許會起到重要作用。有研究報道,由ICEs攜帶的ARGs在驅動不同的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原體的多重耐藥性中起關鍵作用。
 
轉座子(不含接合性轉座子)和整合子所攜帶的ARGs無法在細胞間移動,但可以通過“搭便車”進入細胞間的移動元件增加基因水平轉移的可能性。
 
一般而言,比起染色體上的,在質粒上的轉座子和整合子常被發現與ARG有著更緊密的聯系(圖1)。質粒攜帶6種類型(甲氧芐氨嘧啶,氯霉素,磺酰胺,四環素,β氧內酰胺和氨基糖苷)與整合子和轉座子密切相關的ARB,但染色體只檢測到2類(氯霉素和磺酰胺)。表明質粒和ICEs攜帶了污水處理廠耐藥基因組的大部分ARG,而轉座子和整合子可能進一步增加了質粒介導的ARG的流動性。
 
對整個處理過程中ARGs進行動態分析,結果表明出水口中攜帶ARGs的質粒和ICE的比例(62 to 66%)要比進水口(54 to 57%)和活性污泥(41 to 53%)樣品中的更高(P < 0.01)。這與Petrovich的研究結果一致,即與進水口樣品相比,出水口樣品中與MGE相關的ARG的相對豐度增加了。這可能說明廢水處理廠產生的廢水對與MGE相關的ARGs在出水中的擴散構成了挑戰。
 
3.通過移動原件和宿主追蹤識別廣譜可持續抗性基因
 
由于觀察到了顯著的耐藥基因轉移,因此本研究對攜帶抗性基因的可移動元件和基因組進行追蹤。結果發現8種類型的29個由質粒攜帶的抗性基因亞型在至少一個污水處理廠的進水和出水中同時存在,其中有23個存在于該研究所分析的三個污水處理廠中,10個(aadA,aadA2,blaA,VEB-3,catB,cmlA,mefC,mphD,sul1和tetA)在出水口樣品中檢測到(圖3)。
 
值得注意的是,質粒攜帶的tetA(四環素抗性)基因和sul1(磺酰胺抗性)基因在三個污水處理廠的所有區室中都存在。但是由于它們能夠跨不同物種進行基因水平轉移,因此僅僅基于宏基因組測序目前無法確定質粒宿主,未來可通過Nanopore宏基因組和Hi-C結合幫助此類研究。
 
研究還跟蹤了ICEs攜帶的ARGs,結果顯示在三個污水處理廠都能檢測到四個ARG(cfxA,mefA/,tetQ和tetM)。其中cfxA和tetQ基因均由來自擬桿菌的ICE攜帶。由于基因水平轉移的存在,擬桿菌中的tetQ已從大約30%急劇增加到80%以上。擬桿菌作為人類結腸中最主要的厭氧菌,當釋放到污水處理廠中時可作為積累ARG的宿主。
 
此外,本研究還檢測到了攜帶mef(A/E)和tetM基因的類Tn916鏈球菌ICE。因此,ICEs在污水處理廠中的普遍存在使其成為在人類病原體和環境細菌之間傳播各種ARG的重要載體。
 
本研究還確定了位于染色體上的ARG的宿主和分布模式(圖2c)。結果表明,整個污水處理廠中所有宿主包含了相同的ARG亞型,并顯示出高穩定性。這些具有高移動風險的抗性基因在污水處理廠中的多樣性很高,可能是造成水體中抗性基因傳播的重要原因。


Fig 2 通過移動原件和宿主追蹤識別廣譜可持續抗性基因
 

4.快速鑒定污水處理體系潛在耐藥致病菌群

快速識別抗生素耐藥菌群對于污水處理中實現病原體有效控制是十分必要的,納米孔測序可以實時、快速的檢測并跟蹤污水處理廠潛在的ARP。本研究共檢測到16種相對豐度大于2%的物種,其中10種是潛在的致病菌,占所有已鑒定ARB的48.7%(圖3a)。這些細菌大部分屬于Gammaproteobacteria類(74.4%),包括Aeromonas、Escherichia、Klebsiella、Acinetobacter和Pseudomonas。大部分致病菌為多重耐藥菌株,所攜帶的抗性基因涵蓋了6大抗性類型(圖3b).
 
在此之前,已經通過基于培養技術報道了這些潛在的ARPs在污水處理廠中普遍存在的抗性基因,包括對碳青霉烯耐藥的鮑曼不動桿菌,對多重耐藥的糞腸球菌和產生CTX-M的肺炎克雷伯菌。作為全世界醫院感染的主要原因,減少這些ESKAPE病原體的檢測時間對于風險管理至關重要。納米孔測序可以在收到樣品后不到24小時內顯示ARPs信息,這大大減少了從樣品收集到結果交付所需的時間。
 

 
Fig 3 快速破譯潛在耐藥致病菌群

 
通過追蹤監測這些潛在致病菌群,結果與預期的一致,進水樣品具有最高的ARP多樣性。 然而,在所有處理階段都發現了5個種群,包括3種ESKAPE病原體(圖3c),而艱難梭菌僅在進水和出水中檢測到。這些結果表明,這些多重耐藥致病菌株很有可能通過污水處理廠的處理過程進入下游接收環境,進一步強調了有效污水消毒的重要性。

 
5.基因型表型關聯分析揭示質粒對于多重耐藥菌株的重要貢獻

表型與基因型的結合被用于進一步驗證細菌攜帶的質粒在污水處理廠中的持久性。從三個污水處理廠的進水和出水培養物中鑒定出可同時對四種不同的抗生素家族(包括氨芐青霉素,卡那霉素,四環素和氯霉素)產生抗性的細菌。這些多重耐藥菌株主要分布于8個物種(圖4a),其中大部分屬于人類潛在致病菌。
 
其中最主要的成員是大腸桿菌,分別占所有鑒定出的耐藥菌的67.5%和72.9%。在處理過程中,有效去除了進水中的Citrobacter and Elizabethkingia。 此外,出水口培養物中肺炎克雷伯菌的相對豐度增加(從6.7%增加到15%)。

 

Fig 4進出水多抗耐藥菌株基因型表型關聯分析


為了驗證基于納米孔測序的微生物群落分析的準確性,對混合進水的多重耐藥培養物進行了Illumina宏基因組測序。結果表明,使用Illumina測序數據生成的分類結果在優勢種水平上與納米孔測序獲得的分類結果基本一致。用宏基因組序列和16S rRNA(V4和V6的區域)基因在科水平的分類結果一致。
 


Fig S3 在Illumina和Nanopore測序平臺上,分別從種水平和科水平對混合的多重耐藥性混合培養細菌的豐度進行了比較。
 

此外,成功重建了相對高豐度物種的近全長的16S rRNA序列。抗性基因譜與給定篩選抗生素的表型高度相關,其中氨基糖苷類抗性基因最為豐富,其次是β列內酰胺類、四環素和氯霉素。除此之外,還檢測到五種與磺胺類、奎諾酮類、甲氧芐啶類,利福霉素類和博來霉素相關的抗性基因,說明多種抗性基因的共現性普遍存在于該研究所篩選的多重耐藥菌株中(圖4b)。
 
 

Fig 4 進出水多重耐藥菌株基因型表型關聯分析

 
最為重要的是,除了acrD 和AmpC抗性基因,其它檢測到的抗性基因由質粒攜帶(圖4c), 這表明持久的抗藥性主要是由質粒賦予的。在檢測到的ARG類型中,檢測到的氨基糖苷亞型(十個亞型)比β個內酰胺(五個亞型),氯霉素(五個亞型)和四環素(四個亞型)更多(圖4c)。
 
然而,還檢測到幾種氨基糖苷亞型,例如aph(3h還-Ib,aadA和aph(6)-Id,但預測能造成對鏈霉素產生抗藥性,而不是對卡那霉素產生抗藥性,這表明氨基糖苷抗性基因,它們更可能與ARGs的其他亞型同時出現,這與圖4b中觀察到的高豐度一致。但是由于目前尚無法通過構建一致性序列來提高Nanopore reads的準確性,因此將原始的未修飾reads用于上述分析可能更好。
 

6.質粒攜帶的多耐藥基因簇 

最后研究了位于質粒上的ARG的排列,考慮到本研究中使用的抗生素,僅對在進水和出水培養物中同時編碼至少四種類型的ARG的reads進行了分析。這些reads包含與質粒接合有關的基因,說明在多重耐藥菌中存在結合質粒,多個ARGs常常同時定位在同一個接合質粒上,這使得多重耐藥性相對容易傳播。
 
例如,reads_1 (42,639 bp)攜帶11個ARGs,這些ARGs可能導致對多種抗生素類的耐藥性。此外,還鑒定出一個完整的1類整合子攜帶AAC(6 ')-Ib-cr、ar-3、drfA和aadA16。這種多重耐藥基因簇的復雜結構很容易在納米孔超長reads的基礎上得到解決。
 
此外,不同的氨基糖苷ARG亞型在同一質粒上同時出現(圖5),如在read_4上同時出現三種亞型(APH(6)-Id、APH(3”)-Id和APH(3’)-I),在其他reads上也有類似的排列。除了ARG亞型間的共現模式外,Nanopore長序列還鑒定了編碼汞抗性的基因簇(merA、merC、merD、merE、merP和merR)。
 


Fig 5 質粒攜帶的多重耐藥基因簇

 
值得注意的是許多類型的插入序列(IS)和可轉座(Tn)元件在這些接合質粒上顯示出鑲嵌分布,這可能會增加基因轉移水平的可能性。實際上,這些豐富的重復序列會導致Illumina reads 的組裝困難,而使用納米孔測序技術可以在很大程度上克服這一困難。
 

7.基于NanoporeIllumina測序進行抗性基因定量比較

將通過Nanopore測序得到的主要ARG類型的豐度(以每百萬堿基對的ARG數量計)與通過Illumina測序的豐度進行比較,結果表明,除了兩個活性污泥樣本(STAS和SWHAS),兩個測序平臺分析的ARG的定量結果具有相似性。測序深度不足,活性污泥中高度復雜的群落和相對較低的ARGs豐度可能是到導致活性污泥樣本的巨大差異。
 
過去使用不同的測序策略對ARG的定量也有不同的報道,其中一些ARG亞型僅通過Nanopore測序檢測到,另一些ARG亞型僅通過Illumina測序鑒定到。此外,平臺差異和不同的ARG預測算法也可能影響ARGs的定量結果。



Fig S2 Nanopore 和 Illumina 定量結果相關性分析

總結
 
該研究充分利用了Nanopore測序長讀長、實時測序的優勢,結合Illumina測序,開發了一套基于高通量測序的抗性基因遺傳背景解析、宿主鑒定的分析流程 。Nanopore極大地促進了多重耐藥性結合質粒的研究,分析流程不僅使我們對污水處理體系可移動抗性基因組有了全新的見解,同時為進一步解析耐藥菌株的產生以及傳播機制提供了重要參考。

 
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